导读：2017年12月，中国科学院动物研究所王皓毅团队在Frontiers of Medicine 发表封面文章《利用CRISPR/Cas9在CAR-T细胞中敲除免疫检查点LAG-3》(标题原文：CRISPR-Cas9 mediated LAG-3 disruption in CAR-T cells)，聚焦靶向基因编辑技术及肿瘤免疫治疗研究。为了更好地帮助读者了解这一前沿领域，Frontiers of Medicine 编辑部特别邀请文章第一作者张永平撰文介绍相关研究背景和潜力。
近年来，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）在肿瘤免疫治疗领域发展迅速，2013年被Science杂志评为生物医学领域“十大科技突破”之首。CAR是一种人工T细胞受体，主要结构包括三个部分：来源于单克隆抗体单链可变区的抗原识别区、跨膜区和来源于CD3ζ和（或）共刺激分子的胞内信号转导区。CAR-T在治疗难治性复发性B细胞急性淋巴细胞白血病的早期临床试验中获得巨大成功，完全缓解率高达70%−90%。然而，CAR-T在治疗其他CD19阳性的血液肿瘤（如慢性淋巴细胞白血病）时效果却要差很多，总体反应率在50%左右，可能与T细胞免疫检查点介导的免疫抑制性信号有关，导致T细胞耗竭。同样，由于肿瘤免疫抑制性微环境的影响，CAR-T治疗实体瘤更是差强人意。
通常所说的免疫抑制性信号通路是指免疫检查点（immune checkpoints）在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用，尤其是选择性抑制肿瘤特异性T细胞的功能。
淋巴细胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3, LAG-3）是一种重要的免疫检查点，在调节T细胞免疫应答中发挥着十分微妙的作用。LAG-3的结构与CD4相似，配体都是MHC II类分子，但亲和力比CD4要高。此外LAG-3也会与LSECTin发生交联反应。LSECTin分子是一种C型凝集素，属于DC-SIGN家族，主要表达于树突状细胞，也会表达在某些肿瘤组织中。LAG-3主要表达于活化后的效应T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、B细胞及浆细胞样树突状细胞。
越来越多的证据表明，无论在体内还是体外，LAG-3都会负调控效应T细胞的功能（活化、细胞因子释放和细胞杀伤），同时会增强调节性T细胞的免疫抑制功能。LAG-3还是T细胞耗竭的一个标志，在肿瘤和慢性感染环境中，LAG-3的表达会在T细胞表面明显上调，通过单克隆抗体阻断LAG-3，会增强T细胞的增殖和细胞因子释放，而且会延迟细胞周期停滞，增加记忆T细胞亚型的比例。在慢性感染和肿瘤的临床前研究发现，PD-1和LAG-3在促进免疫逃逸的过程中发挥协同作用，同时阻断PD-1和LAG-3信号通路可以逆转T细胞耗竭，提高T细胞抗感染和抗肿瘤的能力。目前单独使用LAG-3抗体或联合使用PD-1抗体和LAG-3抗体治疗血液肿瘤和实体瘤的临床试验正在进行。
过继性细胞输注前，体外通过靶向基因编辑技术永久敲除CAR-T细胞上的免疫检查点受体如PD-1和LAG-3，也许能够提高CAR-T的功能，而且能够避免长期系统使用单克隆抗体所带来的潜在副反应。有研究报道在T细胞或CAR-T细胞中敲除PD-1能够增强T细胞或CAR-T细胞抗肿瘤功能。但目前还没有关于T或CAR-T细胞敲除LAG-3的报道。我们的研究首次利用CRISPR-Cas9系统在T细胞和CAR-T细胞中进行LAG-3的敲除，并观察基因编辑后的T和CAR-T细胞免疫表型和功能变化。
我们利用CRISPR-Cas9技术，能够有效地在T细胞和CAR-T细胞中进行LAG-3基因敲除。与以往的小鼠体内研究不同，我们没有发现LAG-3敲除后T和CAR-T细胞增殖能力增加。此外，电转程序不会明显影响T和CAR-T细胞免疫表型，以中央记忆性T细胞为主。LAG-3敲除的CAR-T细胞能够维持抗原特异性细胞因子释放和体内外抗肿瘤功能。
然而，先前的研究发现通过单克隆抗体阻断LAG-3后会增加抗原特异性T细胞细胞因子释放水平和体内外对肿瘤细胞杀伤功能。我们目前的研究没能证明LAG-3敲除后的优势。一个可能的原因是我们的小鼠肿瘤模型不能模拟免疫抑制性肿瘤微环境，因此不能显出LAG-3敲除CAR-T抵抗T细胞耗竭的优势。另一方面，LAG-3和PD-1在介导肿瘤免疫逃逸的过程中发挥协同作用，单独阻断LAG-3的功能可能不足以提高CAR-T细胞抗肿瘤的功效。因此，还需要进一步研究PD-1和LAG-3同时敲除的CAR-T细胞，并在能够更好模拟肿瘤微环境的小鼠模型如病人来源肿瘤细胞移植模型上验证其功能。
总之，我们目前建立了利用CRISPR-Cas9系统在T细胞或CAR-T细胞中高效敲除LAG-3的方法，而LAG-3敲除CAR-T的潜在优势需要进一步研究，利用靶向基因编辑技术敲除免疫检查点是改进CAR-T治疗实体瘤非常有希望的策略。
（撰文：张永平 航天中心医院血液科）
访问http://journal.hep.com.cn/fmd/EN/10.1007/s11684-017-0543-6，可以直接浏览或者下载CRISPR-Cas9 mediated LAG-3 disruption in CAR-T cells 全文。
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