论文标题：SWISS: multiplexed orthogonal genome editing in plants with a Cas9 nickase and engineered CRISPR RNA scaffolds

期刊：Genome Biology

作者：Chao Li, Yuan Zong et.al

发表时间：2020/06/16

数字识别码：10.1186/s13059-020-02051-x

微信链接：点击此处阅读微信文章

CRISPR/Cas9系统已经被打建成一个超级的分子工具箱。来自酿脓链球菌（Streptococcuspyogenes）的Cas9蛋白由RuvC和HNH两个核酸酶结构域组成，分别切割非靶向链和靶向链。通过突变第10位的天冬氨酸(Asp10)和/或第840位的组氨酸（His840），Cas9便成为一个切口酶nCas9或失去核酸酶活性的dCas9。Cas9用来在基因组上产生DNA双链断裂（Double Strand Break, DSB）；成对的nCas9也可以用于在基因组上产生DSB，nCas9 (D10A)还被用于胞嘧啶碱基编辑系统（Cytosine Base Editor, CBE）和腺嘌呤碱基编辑系统（Adenine Base Editor, ABE）的开发；dCas9常被用于融合各种效应蛋白进而实现CRISPR介导的基因转录激活（CRISPR Activation, CRISPRa）、基因转录抑制（CRISPR Interference, CRISPRi）、基因组成像以及表观遗传修饰等。但是，将CRISPR/Cas9系统及其衍生技术系统应用于多重编辑时，往往只能执行一种类型的基因组编辑事件。

目前，已经开发多重正交的基因组编辑策略主要包括以下几个方面：一种策略是利用截短的sgRNA控制Cas蛋白核酸酶活性来调控基因的表达，同时利用全长的sgRNA在另一位点进行基因敲除；第二种策略是将RNA配体的发夹结构整合到sgRNA骨架上，形成支架RNA（Scaffold RNA, scRNA），dCas9/scRNA复合体通过发夹结构招募基因激活或抑制因子，在不同的位点同时实现基因转录激活和抑制的双重功能；第三种策略是使用多个同源的CRISPR系统在不同的靶位点同时实现基因激活、抑制和删除三重功能。这些基因组工程的多重策略多是在细菌、酵母和人类细胞中开发的，可用于产生不同编辑类型的植物多重基因组编辑系统的报道仍比较少。

与Cas9和dCas9相比，nCas9在多重基因组编辑上的潜力并没有完全开发出来。由于CBE和ABE都使用相同的nCas9 （D10A），因此，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞课题组近期在开放获取期刊Genome Biology 上发表了基于一个nCas9核酸酶的多重正交基因组编辑系统，并命名该系统为单系统产生的同时多重编辑系统（Simultaneous and Wide-editing Induced by aSingle System, SWISS）。SWISS利用两个含有不同RNA配体的RNA scaffold （scRNA）分别招募相应结合蛋白融合的胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶，同时在不同的靶位点分别实现CBE和ABE两种碱基编辑。再利用nCas9的切口酶活性，将成对的sgRNA引入到SWISS系统中，可以在第三个靶位点处产生DSB，使得SWISS成为具有三重（C-to-T、A-to-G和Knock out）编辑功能的CRISPR系统。高彩霞研究组博士生李超为本文第一作者，高彩霞研究员和王延鹏青年研究员为共同通讯作者。

图：SWISSv3介导的CBE、ABE和Knock out三重编辑活性

上：SWISSv3策略示意图；下：水稻原生质体中测试的两组靶位点

研究者首先对RNA配体招募的CBE和ABE碱基编辑载体进行了优化，进一步使用报告系统对分别用于介导CBE和ABE碱基编辑功能的高效scRNA进行了高通量的筛选，并用水稻内源靶位点对候选scRNA进行了验证。最终选择了具有3¢端RNA配体的esgRNA-2×MS2和esgRNA-2×boxB，分别用于介导的CBE和ABE的碱基编辑功能。开发的SWISSv1.1用于实现C-to-T和Knock out双重功能编辑；SWISSv1.2用于实现A-to-G和Knock out双重功能编辑。在SWISSv2中同时表达胞嘧啶脱氨酶模块和腺嘌呤脱氨酶模块，实现C-to-T和A-to-G双重功能编辑；在SWISSv2中引入成对的sgRNA，成为SWISSv3，实现C-to-T、A-to-G和Knock out三重功能编辑(图)。并且，使用Cas9的PAM变体Cas9-NG进一步拓展了SWISS系统在基因组上的靶序列选择。在水稻植株中，SWISSv3在水稻植株中同时产生三种编辑事件的效率为7.3%。

SWISS技术体系的建立，有望用于植物分子设计育种、基因性状叠加和调控通路的改变等。此外，本研究中使用正交的RNA配体-结合蛋白对，如MS2-MCP、PP7-PCP、boxB-N22p、Com-com，进一步扩展了用于植物合成生物学研究的工具箱，有利于在植物体内执行综合的信号通路、基因通路以及生物传感器的控制研究。

图2

Genome Biology covers all areas of biology and biomedicine studied from a genomic and post-genomic perspective. Content includes research, new methods and software tools, and reviews, opinions and commentaries. Areas covered include, but are not limited to: sequence analysis; bioinformatics; insights into molecular, cellular and organismal biology; functional genomics; epigenomics; population genomics; proteomics; comparative biology and evolution; systems and network biology; genome editing and engineering; genomics of disease; and clinical genomics. All content is open access immediately on publication.

摘要：We describe here a CRISPR simultaneous and wide-editing induced by a single system (SWISS), in which RNA aptamers engineered in crRNA scaffold recruit their cognate binding proteins fused with cytidine deaminase and adenosine deaminase to Cas9 nickase target sites to generate multiplexed base editing. By using paired sgRNAs, SWISS can produce insertions/deletions in addition to base editing. Rice mutants are generated using the SWISS system with efficiencies of cytosine conversion of 25.5%, adenine conversion of 16.4%, indels of 52.7%, and simultaneous triple mutations of 7.3%. The SWISS system provides a powerful tool for multi-functional genome editing in plants.

（来源：科学网）