论文标题：Novel Epigallocatechin-3-Gallate (EGCG)-Loaded Mesoporous Bioglass Scaffolds for Bone Recruitment Applications （新型表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)负载介孔生物玻璃支架骨补充应用）

期刊：Applied Sciences

作者：Shih-Fu Ou, Yuan-Li Tsao, Wei-Chun Lin, Yi-Ting Wang, Liping Wang and Fang-Yu Fan

发表时间：29 December 2020

DOI：10.3390/app11010243

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骨组织修复是再生医学的重要研究方向之一，支架材料在其中扮演着尤为重要的角色。有效的支架材料具有诸多性能要求：不锈钢等第一代骨材料容易引起组织排异等反应，合格的支架需要能够与骨组织相容；其次，支架材料需要具备多孔结构，能够容纳细胞，并提供其生长空间；此外，一定的药物负载能力及可控释放可以帮助向骨组织给药，辅助骨细胞的生长；最后，支架材料还需要具有一定抗菌性能，能够在促进骨细胞生长的同时，有效抵御细菌感染。

以生物玻璃为代表的生物陶瓷，是符合上述要求的骨组织支架材料之一。生物玻璃的主要成分为SiO₂、CaO和P₂O₅等氧化物，可以有效与骨组织相容。此外，生物玻璃具备快速离子交换能力，因此与骨组织具有较强的结合作用，且其表面释放的钙离子和磷酸根离子可以有效促进骨组织再生。

表没食子儿茶素没食子酸酯 (Epigallocatechin-3-Gallate, EGCG) 是绿茶茶多酚的主要组成成分之一，是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗肿瘤作用。近年来其药理作用得到不断开发，在再生医学领域具有广阔的应用前景。

来自台北医科大学 (Taipei Medical University, TMU) 牙科技术学院的Fang-Yu Fan教授课题组通过泡沫交换技术制备了多孔生物玻璃支架，选取EGCG作为抗菌剂，开发了一种能够促进骨细胞增殖并有效抗菌的组织工程支架材料，并将相关研究成果发表在了Applied Sciences 期刊。

支架材料制备

研究人员首先将四乙氧基硅烷、磷酸三乙酯、硝酸钙等组分溶解混合，得到前驱体溶液；然后将市售海绵浸泡其中，吸附充分以后，进行离心、烘干；最后在700 ℃下烧结半小时，即得到了生物玻璃支架。若在前驱体溶液中加入抗菌剂EGCG，即可得到EGCG修饰的生物玻璃支架。

制备出材料后，研究人员通过扫描电子显微镜 (SEM) 观察材料微观结构，使用X射线衍射 (XRD) 分析其晶体结构，并采用氮气等温吸附脱附测定了多孔结构类型。随后进行抗菌剂的抑菌测试，并研究生物玻璃对抗菌剂的负载及释放行为，完成细胞毒性实验。

实验过程及结果

首先使用扫描电子显微镜 (SEM) 对生物玻璃支架进行微观形貌观察。图1中可以看到，烧结之后的成品仍然保留着海绵的多孔结构，孔间距300–480 μm，表面较少出现裂纹分布。通过X射线衍射 (XRD) 分析生物玻璃支架的结晶结构，在2θ = 22°处观察到标准非晶硅峰，说明非金属氧化物主要以无定型形式存在。此外，通过BJH法分析氮气等温吸附脱附曲线，结果显示其属于IV形等温吸附，表面存在大量10–20 nm孔道，这使得支架展现出良好的细胞粘附性能，并有利于药物的吸收和释放。

图1. 生物玻璃支架烧结前后 (A) X射线衍射谱图及扫描电子显微镜照片，(B) 氮气等温线吸附脱附曲线及孔径分布。

可见，该生物玻璃支架十分有利于药物负载，而负载量则是实际应用中的重要参数，研究人员接着对EGCG的抗菌效果进行探究。首先选取大肠杆菌 (E菌) 和金黄色葡萄球菌 (S菌) 作为革兰氏阴性菌和阳性菌的典型代表；随后，在培养液中加入不同浓度的EGCG，确定EGCG的最低抑菌浓度。结果显示如图2，25 μg/mL EGCG即可对S菌起到有效杀菌作用，而对E菌需提高到200 μg/mL以上。由此确定，需使用浓度为200 μg/mL的EGCG溶液制备载药生物玻璃支架。

图2. E菌 (左) 和S菌 (右) 在不同药物浓度下的生长情况。

为探究生物玻璃支架促进生成骨结构的能力，研究者将支架材料浸泡在SBF无菌模拟体液中，研究支架材料与体液成分的相互作用 (如图3)。浸泡14至28天后，观察到支架表面有纳米颗粒产生，可以相互连结成膜。而X射线衍射证明，这些颗粒是化学组成、结晶度、晶粒度及形貌等都类似于自然骨组织的磷灰石。这说明该生物玻璃支架能够矿化人体体液中的有效成分，产生类骨结构，达到促进骨再生的能力。

图3. (a) MBG支架和EGCG-MBG载药支架浸泡14及28天后的X射线衍射谱图，(b) 支架及 (c) 载药支架浸泡28天后的扫描电子显微镜照片。

确定生物玻璃支架可以促进骨组织再生后，研究者对其药物的负载和释放过程进行了探索。如图4所示，药物EGCG在274 nm紫外光下具有强烈吸收，且吸光度与浓度线性相关，因此，测定吸光度即可计算对应药物浓度。将20 mg载药支架浸泡于10 mL磷酸盐缓冲溶液中，持续监测释放出的浓度，结果显示，初始24 h内累计释放出68.71%药物；24 h后持续释放，在长达10天内缓慢释放出75.37%。这一结果表明支架的介孔结构为EGCG浓度长期保持在有效剂量提供了可能。

图4. (a) 不同浓度EGCG溶液在274 nm紫外光下的吸光度，(b) 载药支架中药物的累积释放率随时间的变化。

接着，研究者进一步评估了支架材料对细胞生长的影响。选取人骨肉瘤细胞MG63培养，在培养过程中加入载药及未载药支架，最后通过CCK-8法观察存活细胞数量。结果如图5显示，两种支架均具有较低的细胞毒性，但在促进细胞增殖方面又展现出差异。适当浓度的EGCG (200 μg/mL) 可以防止细胞凋亡，甚至直接促进细胞增殖，这可能与EGCG能够迅速清除自由基，保护细胞活力有密切关系。

图5. MBG支架和EGCG-MBG载药支架的24 h及48 h细胞毒性。

综合上述一系列的表征和测试，结果表明该支架材料具有出色的骨再生、药物负载及持续释放、促进细胞增殖能力，是一种非常有前景的骨科临床应用新材料。

期刊简介

Applied Sciences (ISSN 2076-3417, IF 2.679) 是一个国际型开放获取期刊，主要发表应用自然科学研究领域的相关论文，期刊主题涵盖光学和激光、应用化学、纳米技术和应用纳米科学、环境和可持续发展、应用生物学以及计算与人工智能等领域。Applied Sciences 采取单盲同行评审，一审平均周期约为14.1天，文章从接收到发表仅需2.7天。