论文标题：In Vitro and In Vivo Anti-Candida Activity and Structural Analysis of Killer Peptide (KP)-Derivatives（潜在的抗真菌药物——关于KP衍生物的研究成果）

期刊：Journal of Fungi

作者：Tecla Ciociola, Thelma A. Pertinhez, Tiziano De Simone, Walter Magliani, Elena Ferrari, Silvana Belletti, Tiziana D’Adda, Stefania Conti and Laura Giovati

发表时间：10 February 2021

DOI：10.3390/jof7020129

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文章导读

AKVTMTCSAS又被称为杀手肽 (killer peptide, KP)，是由Antonio Cassone教授等学者于2003年发现并研究，其来源于重组的酵母杀手毒素样抗独特型抗体的可变区，并且具有抗菌、抗病毒和免疫调节等多种生物活性。除此之外，KP还具有特别的自组装能力，对全身念珠菌感染及粘膜念珠菌感染的动物模型具有治疗效果。

本研究主要进行了KP衍生物 (通过替换或删除KP第一个丙氨酸残基获取) 的相关研究，对其生物活性和结构特性进行了分析，研究表明这些肽在体外和体内发挥不同的抗念珠菌活性，但却对哺乳动物细胞LLC-MK2没有表现出毒性作用。圆二色谱的结果表明，KP的第一个氨基酸残基变化会影响所得肽在溶液中的构象改变。除此之外，KP衍生物还像KP一样可以诱导细胞凋亡，并能促进ROS产生，引起线粒体膜电位的变化，通过共聚焦和透射电子显微镜发现特定的肽可以渗透到白色念珠菌细胞内并引起其总体形态的改变 (如图1)。总体而言，肽中的第一个残基变化对肽的构象及其抗念珠菌活性很重要，并可能对抗菌作用机制有影响。

图1. KP及其衍生物的生物活性及处理白色念珠菌细胞60分钟后的透射电镜图。

开发具有良好药代动力学、药效学特性、无毒副作用并能够克服对常规药物耐药性的新型抗菌化合物的需求不断增加。迄今为止，多种来源的抗菌肽被发现是潜在的活性候选分子。鉴于其易于生产、生产成本相对较低以及能够设计新型递送系统的特性，小型抗菌肽可用于开发新一代抗真菌药物。

研究结果

KP及其衍生物的氨基酸序列如图2所示 ，本研究中通过删除或替换第一个非极性氨基酸丙氨酸 (组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸) 获得KP衍生物。

图2. KP及其衍生物的氨基酸序列。

体外杀菌活性

抗白色念珠菌SC5314的实验表明，KP及其衍生物的EC 50介于0.28-1.34 µM且H10S和K10S抗白色念珠菌活性最强。K10S表现出更快速的抗念珠菌作用。K10S在30分钟内达到与KP相近的36.93%的杀灭率，而H10S仅6.85%。L10S抗菌活性最差。

海带多糖存在的情况下体外杀菌的活性

在100 µg/mL海带多糖存在下，H10S、K10S、L10S和Y10S的抗念珠菌活性几乎或完全被中和，KP、P10S和K9S活性则需要双倍浓度的海带多糖 (200 µg/mL) 才可中和。当海带多糖浓度为200 µg/mL时，S10S保留了显著的抗念珠菌活性 (>60%)。

溶血和细胞毒活性

KP及其衍生物在测试浓度 (10、25和50 µM) 下的溶血活性可以忽略不计 (阴性对照为0%溶血、PBS；阳性对照为100%溶血、Triton 1%)，对LLC-MK2细胞没有显著的细胞毒性。

KP衍生物的体内毒性和治疗活性

该研究评估了所有KP衍生物对G. mellonella幼虫的毒性和对实验性白色念珠菌感染的治疗活性，发现对G. mellonella幼虫没有明显的毒性作用。用白色念珠菌SC5314感染幼虫后接种KP衍生物 (对照组为盐水) 发现，KP、K10S、P10S和K9S可显著提高幼虫的存活率，而H10S、L10S、S10S和Y10S则没有明显的治疗效果。

对白色念珠菌细胞的诱导凋亡和ROS产生的影响

除K10S外，KP衍生物均能诱导细胞凋亡。与KP相比，其衍生物在白色念珠菌细胞中的诱导凋亡能力在统计学上看，S10S和Y10S诱导能力显著提高、H10S和L10S诱导能力降低，P10S和K9S未发生诱导能力。

在白色念珠菌细胞中评估了KP及其最活跃的衍生物H10S和K10S对ROS产生的影响，与未处理的细胞相比，通过DCFH-DA氧化成DCFH产生的绿色荧光揭示了ROS的存在。除了KP组60、240分钟及K10S组在60、120分钟外，其余组与抗氧化剂Caspofungin组相比较，其荧光强度均显著降低。

通过共聚焦显微镜和透射电子显微镜 (TEM) 观察发现A10S (KP)、H10S和K10S能够与酵母细胞壁结合并随着时间的推移进入活细胞 (使用FITC标记)

本研究中描述的KP及其衍生物的特殊性质可以使它们成为开发新型抗真菌药物的候选者，如果可以验证其在生理条件下具有足够的稳定性，那么无论是将其应用在局部对抗黏膜念珠菌病还是全身给药上都具有一定的潜力。

Journal of Fungi 期刊介绍

主编：David S. Perlin, Hackensack Meridian Health Center for Discovery and Innovation, USA

期刊主题涵盖了病原真菌、医学真菌学、药用真菌、抗真菌药物耐药性、真菌与健康、真菌与皮炎、寄生真菌、真菌分子系统发育、植物真菌和土壤真菌、真菌毒理学、真菌遗传学和进化、真菌生物学、多样性和生态学、真菌与环境生态的相互作用、真菌应用技术等。目前已被Science Citation Index Expanded (Web of Science)、PubMed、Scopus等数据库收录。