论文标题：Identification and Heterologous Expression of the Kendomycin B Biosynthetic Gene Cluster from Verrucosispora sp. SCSIO 07399（Kendomycin B生物合成基因簇的鉴定及异源表达）

期刊：Marine Drugs

作者：Jiang Chen, Shanwen Zhang, Yingying Chen, Xinpeng Tian, Yucheng Gu and Jianhua Ju

发表时间：26 November 2021

DOI：10.3390/md19120673

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期刊链接：

https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs

原文作者简介

通讯作者

鞠建华，博士生导师，中国科学院南海海洋研究所研究员。主要从事海洋微生物活性次级代谢产物的发现、生物合成和抗感染、抗肿瘤创新药物研发工作。

第一作者

陈姜，中国科学院大学，中国科学院南海海洋研究所直博生，主要从事海洋来源放线菌的活性次级代谢产物的生物合成机制研究。

前言

Kendomycins是安莎霉素类聚酮化合物，具有特殊的全碳环ansa骨架，一个高度取代的吡喃环偶联一个醌发色团。此类化合物具有多样的生物活性，包括抗菌、抗骨质疏松和抗肿瘤等。活性机制研究亦表明其具有多效性，例如调节阳离子和抑制蛋白酶体等。Kendomycins结构的特殊性和活性的优越性引起了研究者们广泛关注，其化学全合成过程和可能的生物合成途径被相继报导，但对于其全碳环ansa骨架的天然形成机制及参与催化的酶系至今仍未可知，值得深入探究。

本课题组在之前的研究中从一株深海疣孢菌Verrucosispora sp. SCSIO 07399中分离获得了三个新安莎霉素类化合物kendomycin B-D，其中kendomycin B为真正的天然产物，而kendomycin C和D则是kendomycin B的C20位巯基取代衍生物。本次研究则鉴定了kendomyicin B的生物合成基因簇 (kmy)，并进行了异源表达；推测了kendomyicin B可能的生物合成途径，并鉴定其起始单元为3,5-二羟基苯甲酸 (3,5-DHBA)；同时鉴定了一个正调控基因kmy4，并探究了其正调控效应。

实验结果

鉴定kendomycin B的生物合成基因簇及其边界

通过全基因组测序和生物信息学分析，我们找到了kendomyicin B可能的生物合成基因簇 (kmy)——I型/III型PKS (polyketide synthase，聚酮合酶) 杂合基因簇。与前人所报导的基因簇 (ken) 比对发现，kmy基因簇中缺少一个甲基转移酶基因，这与kendomycin B结构中缺少一个甲基是相吻合的；此外，kmy基因簇还包含额外的三个转座酶基因 (kmy1-3) 和一组甲基丙二酰-CoA合成相关基因 (kmy22-25)，但对其进行敲除后并不影响kendomycin类化合物的生产，表明其并非必须的生物合成基因。通过系统的基因敲除确定了kmy基因簇的功能并鉴定其上下游边界分别为kmy4和kmy29 (图1)。

图1. 生物合成基因簇比对。kmy：本研究中kendomycin B生物合成基因簇；ken：前人报导的kendomyicin生物合成基因簇。

起始单元鉴定及kendomyicin B生物合成途径推测

通过基因敲除和化学回补实验确证3,5-二羟基苯甲酸 (3,5-DHBA) 为kendomyicn B真正的生物合成起始单元 (图2)。且基于前人的研究和生物信息学分析结果，我们推测了kendomyicin B可能的生物合成途径：III型PKS负责起始单元的合成，I型PKS负责聚酮链的延伸，NAD(P)依赖的氧化还原酶Kmy5、FAD依赖的氧化还原酶Kmy9和FAD依赖的单加氧酶Kmy13可能负责后修饰过程中ansa骨架的形成 (图3)。

图2. 起始单元化学回补实验。△kmy18：III型PKS基因突变株；Wild type：野生型菌株SCSIO 07399。

图3. Kendomyicin B可能的生物合成途径。

进化树分析将Kmy4归属为LuxR正调控基因kmy4的功能探究家族的LAL型调控蛋白，RT-qPCR (real-time quantitative PCR，实时荧光定量PCR) 比较kmy4基因突变株与野生型菌株中kmy基因簇中基因的转录水平，结果显示突变株△kmy4中kmy基因的转录水平大大降低，表明Kmy4对其具有较强的调控激活作用，证实了其正调控功能 (图4)。

图4. △kmy4基因突变株中kendomycin B合成相关基因的表达变化。

Kendomyicn B基因簇的异源表达

通过BAC (bacterial artificial chromosome) 文库的构建和筛选，获得了携带完整kmy基因簇的质粒pHZAUFXJ-3-J11，并利用“三亲本”接合转移技术实现了kmy基因簇的异源表达 (图5)。

图5. 异源表达HPLC分析结果。Wild type：野生型菌株SCSIO 07399；S. coelicolor M1152：异源表达宿主菌；S. coelicolor M1152::pHZAUFXJ-3-J11：kmy基因簇异源表达重组菌株。

结论

本研究鉴定了kendomyicin B的生物合成基因簇 (kmy)，并通过PKS基因敲除和异源表达实验确证了其功能。系统的基因敲除不仅确定了基因簇的边界还发现了一个正调控基因kmy4，并通过RT-qPCR证实了Kmy4的正调控功能。此外，本研究还推测了kendomyicin B可能的生物合成途径，并通过化学回补实验证明了3,5-二羟基苯甲酸为聚酮链的起始单元。我们推测一组氧化还原酶 (Kmy5、Kmy9和Kmy13) 很有可能参与催化复杂的后修饰环化过程，后续我们将对其进行实验验证以期阐明kendomycin B完整的生物合成途径，并为运用组合生物合成技术的结构改造和活性优化奠定基础。

Marine Drugs 期刊介绍

主编：Orazio Taglialatela-Scafati, University of Naples Federico II, Italy

主题涵盖所有来自海洋活性物质的研究，涉及其发现、鉴定及各方面的应用。

2020 Impact Factor：5.118

2020 CiteScore：6.4

Time to First Decision：11.7 Days

Time to Publication：30 Days