论文标题：Seasonal Characterization of the Endophytic Fungal Microbiome of Mulberry (Morus spp.) Cultivars Resistant and Susceptible to Sclerotiniosis（桑树菌核病抗病品种和感病品种的内生真菌微生物群落的季节特征）

期刊：Microorganisms

作者：Weifang Xu et al.

发表时间：28 September 2021

DOI：10.3390/microorganisms9102052

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期刊链接：

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原文作者介绍

向仲怀 中国工程院院士

西南大学蚕学与系统生物学研究所所长、蚕学遗传育种专家、国家蚕桑产业技术体系首席科学家。向院士长期从事蚕业教育和科学研究，主持建立了中国第一个家蚕基因库，2003年领导完成世界第一张家蚕基因组框架图，2006年领导完成家蚕基因组精细图和全基因组基因芯片；研究发现四川省灾害性蚕病壁虱病病源，为该病的有效防治解决了关键问题；经年研究至今，以家蚕基因组为基点，对相关物种的转基因选择、性状表达机制、抗菌抗病等做出了先进的指导性研究。近年，向院士同步开展了针对作为家蚕的独特食物来源的桑树的研究。

文章导读

植物内生菌群在促进植物生长和健康方面起着重要的作用。本研究采用非培养和纯培养两种方法，研究了四个桑葚菌核病抗性不同的桑树品种 (抗病/感病品种) 的内生真菌群落在不同季节 (春季/秋季) 的差异。核心内生菌群按季节分为两组，春季样品中具有较多操作分类单元 (OTUs) 和α-多样性，而秋季样品中具有较多的真菌纲Dothideomycetes的序列或分离物。通过比较不同的桑树品种，发现感病品种的OTUs总数高于抗病品种，且均存在枝孢菌。值得注意的是，菌核病 (sclcleromitrula shiraiana) 的致病因子仅在感病品种中检测到。结果表明，桑树内生菌群的变化主要与季节变化有关，其次与桑树品种对菌核病的抗性水平有关。

研究过程

1 样品采集和处理

采集8个桑树分枝样品 (2个季节×4个品种)，其中CG、CQ为菌核病抗病品种，HG、XL为感病品种，分别采于春季 (2016年4月) 和秋季 (2016年9月)。

2 内生菌富集

从每个样品中随机选择10个灭菌片段，并混合作为一个重复单元进行内生菌富集。所有样品均进行3次重复处理。

3 DNA提取、ITS基因测序及内生真菌的培养

利用引物扩增内部转录间隔层 (ITS)，根据其BLAST结果进行属水平鉴定和分类。

4 生物信息学与统计分析

为了比较不同桑树样品中真菌群落结构的差异，并考虑到品种和季节对其的影响，建立8个类群和4个仅考虑品种因素的分组。

研究结果

1 基于ITS扩增子序列的内生真菌多样性研究

经过质量控制、筛选、测序分析获得803,114条高质量序列。在2个季节× 4个品种× 3次重复的24份DNA样本中，序列相似性高达97%的OTUs总数有1038个。计算发现无论哪个品种，春季样品中真菌OTUs的α-多样性都高于秋季样品 (图1)。对不同品种而言，感病品种的丰富度和多样性在春季样品中高于抗性品种，而在秋季样品中则不明显。结果表明，季节对内生真菌群落多样性影响较大，其次是寄主品种。

图1. 春、秋季4个桑树品种内生真菌群落的α-多样性分析 (A) Sobs；(B) Chao；(C) Shannon；(D) Simpson。x轴表示桑树品种，y轴表示不同指标的OTU丰度观测值。每个样品n = 3。

2 内生真菌的分类组成

测序结果显示，子囊菌门是所有样品中的优势菌门，其次是担子菌门，其余OTUs未被分类 (图2)。在子囊菌门中，OTUs主要被鉴定为Dothideomycetes和Sordariomycetes。Dothideomycetes主要包括Capnodiales和Pleosporales。Sordariomycetes仅以Hypocreales为代表。此外，Capnodiales以枝孢霉属为主。

基于纯培养法，从所有样品中共获得109株分离菌株，包括1门、3纲、10目、13科、19属。在门水平上，所有分离菌都属于子囊菌门。分离菌包含3个纲，Dothideomycetes、Sordariomycetes和Eurotiomycetes。优势目包括: Hypocreales、Pleosporales和Capnodiales。主要属包括Cladosporium sp.和Fusarium sp.。总体而言，桑树核心内生菌群易于分离和培养。

图2. 春、秋季4个桑树品种的内生真菌门的相对丰度。x轴表示不同样本的菌群，y轴为总菌群的相对丰度。

3 内生真菌群落在春季和秋季的差异

PCoA和聚类分析均表明，春季和秋季样品的真菌群落存在显著差异。真菌OTUs的数量由春季813个下降到秋季652个。组合样品中特有的OTUs数量也从春季386个下降到秋季225个。此外，群落组成分析表明，春季样品中的优势真菌门-子囊菌门为59.61%，而在秋季样品中增加至75.96%。在春季和秋季样品中担子菌门分别为9.96和5.41%。总之，内生真菌群落在不同季节的组成和分布均不相同。

4 四个桑树品种内生真菌组成的比较分析

无论季节的影响如何，观察到的真菌OTUs总数在XL中最高，其次是HG、CG和CQ。感病品种共有的OTUs数量 (HG、XL) 远高于抗病品种 (CQ、CG)。此外，感病品种XL特有的OTUs数量高于HG，而抗病品种CG高于CQ。在门和纲水平上，4个品种的真菌群落无明显差别。在目水平上则存在一定差异。结果分析表明，感病品种中各类群的相对丰度是相似的，而抗病品种中存在着显著的差异。

5 季节对菌核病抗性不同的桑树内生真菌组成影响

相对于春季样品，HG、XL和CQ在秋季样品特有的OTUs数量明显减少。在CG中，春季样品和秋季样品特有的OTUs数量几乎相同，共有的OTUs数量在4个品种中最高 (图3A)。PCoA分析也表明，两个季节的样品间存在较大差异。总的来说，季节变化对桑树真菌群落的组成起着至关重要的作用，而CG的真菌群落则具有相对的稳定性 (图3B)。

图3. 4个桑树品种春、秋季样品的内生真菌丰富度比较。(A) 春季和秋季OTUs数量的维恩图。不同颜色代表不同样品组。数值表示OTUs数量。(B) PCoA分析。每个样品n = 3。

另外，基于非培养法，研究者发现Scleromitrula shiraiana仅在感病品种 (SH、SX) 中被鉴定出来，而通过纯培养法则未发现其分离株，这可能与该属的丰度较低有关。上述结果表明，菌核病病原体仅存在于春季感病品种的内生真菌群落中。

研究结论

采用高通量测序和纯培养法，对4个抗性不同的桑树品种在春、秋季的内生真菌群落进行了研究。结果表明，不同桑树品种之间的群落组成和多样性存在显著差异，主要受季节变化影响，其次受寄主基因型影响。此外，桑树品种的抗性可能在一定程度上影响病原菌的定殖。

本研究拓宽了我们对桑树微生物群落调节因子的认识，并为桑树内生菌作为生物防治剂在提高抗性和促进生长方面提供了重要依据。

Microorganisms期刊介绍

主编：Martin Von Bergen, Department of Molecular Systems Biology, Helmholtz Centre for Environmental Research—UFZ, Germany

期刊主题涵盖微生物学的各个研究领域，重点刊载环境、植物、食品、肠道、医药、技术等微生物相关领域的学术文章。现已被SCIE (Web of Science)、PubMed (NLM)、Scopus等重要数据库收录。

2020 Impact Factor：4.128

Time to First Decision：15 Days

Time to Publication：33 Days