最近，来自巴黎综合理工学院、法国国家科学研究中心和法国国家健康与医学研究院的科研人员利用SHG显微镜在10个完整且未被染色的人类角膜的全部深度范围内观察了胶原蛋白的分布情况，并且能够利用外延式探测中小相干长度的优势，使角膜的片状结构得到改善。

研究背景

角膜是眼睛的最前部，并有着透明性和屈光力的特征。尽管眼压和外部冲击每天都在变化，但其机械性能对于保持相同的曲率和随后的屈光能力至关重要。所有这些特性都与角膜的主要基质层的结构密切相关。角膜中心的基质厚度约为500 µm，由1-3 µm厚的胶原蛋白纤维（直径约为30 nm）堆叠而成的薄片组成，排列较为整齐，以确保角膜透明。这些片层大致平行于角膜表面组织，在连续的片层中具有不同的胶原取向。然而，这些片层的分布以及它们在角膜表面上的大小和方向随着角膜的深度而变化。例如，在基质的前部，片层是交织的，胶原纤维可以从一个片层延伸到下一个，而在后部基质中，片层似乎堆叠的更加规则。总之，由于传统技术的限制，角膜的各向异性分级组织及其对角膜生物力学的生理影响尚未得到准确的表征。

透射和扫描电子显微镜是非常强大的成像方法，可以分辨角膜片层内的胶原蛋白纤维，并显示相邻角膜片层之间胶原取向沿角膜深度的急剧变化。然而，它们是视野有限的二维成像技术，不适合对直径约10毫米的500 µm厚组织进行精确表征。光学相干断层扫描（OCT）和反射共聚焦显微镜是临床眼科常用的三维（3D）成像技术，但它们很难分辨胶原片层，也无法显示其方向。X射线散射已成功地用于测量角膜全厚度上胶原片层的平均取向。研究表明，胶原片层主要沿着角膜中心的鼻颞轴和下上轴定向，而与周边相切的定向主要在周边。此外，在厚的角膜横切面上的微焦点X射线散射显示了这些层片从中心到边缘和通过深度的倾斜度的差异。然而，这项技术无法通过基质的深度分辨片层内的平面内胶原取向，并且横向分辨率有限。

二次谐波生成（SHG）显微镜是目前原位显示未染色生物组织中胶原蛋白3D组织的金标准技术。这种多光子模式已经在人类角膜中与双光子激发荧光（2PEF）相结合使用，以观察角膜细胞，即频闪内的细胞。然而，通常没有偏振分辨率的epi检测的SHG图像是均匀的，除了与基质条纹相关的低信号线，这些低信号线对应于片层的波动，并且可能具有吸收眼内压和外部冲击增加的机械作用。另一方面，反式检测的SHG图像表现出较长的相干长度，其可以包含具有相反极性的胶原原纤维，从而导致沿着胶原原纤维定向的条纹图案。所以在显示交叉条纹的大量体素中，胶原取向没有得到有效处理。因此，到目前为止，还没有关于人类角膜的完整多尺度结构的报道。

在这项研究中，研究者实现了偏振分辨SHG（P-SHG）显微镜，并表明P-SHG信号的外延检测是一种有效而精确的方法，可以在人类角膜的整个深度（500至600 µm）上可视化胶原取向。研究者优化了P-SHG成像协议，以获得可靠的深度P-SHG数据，并实现了数据处理工作流程，以自动估计每个体素中的平均胶原蛋白方向以及该测量的精度。使用这种方法，研究者获得了10个人类角膜全深度上胶原蛋白取向的3D重建，以及沿着角膜深度的片层取向分布

创新研究

研究者们使用P-SHG显微镜测量了10个人角膜中心的胶原取向。图1.a显示了人类角膜的横向组织学切片和基质中胶原片层结构的初步方案。P-SHG图像叠层是使用表面几何形状在角膜的整个厚度上记录的（图1.b和c）。研究者在每个像素中获得3种类型的信息：（i）作为SHG信号在所有线性偏振上的逐像素平均值获得的图像，其类似于用圆偏振激发和相同的总采集持续时间采集的一般SHG图像，（ii）胶原蛋白纤维的平面内取向φ的图谱和（iii）决定系数R²的图谱。使用表观和透射检测的典型图像如图1.d1-d2所示。由于SHG过程的相干长度不同，它们表现出不同的特征。

图1 未染色人眼角膜的P - SHG成像原理。

由于P-SHG对偏振畸变很敏感，研究者采用了两种方法来验证这些定向测量的有效性并评估其精度。第一种方法适用于在每个深度或特定轴向区域获得视场中的方位分布。它比较了每个角膜不同方位的一系列P-SHG采集处理的方位分布。图2显示了在基质的第一、第二和第三部分中处理的取向分布的极坐标图，这里被认为是前基质、中基质和后基质，以及基质的整个厚度（图2.b-e）。第二种验证方法适用于方向图的每个体素。通过同时采集反式检测的图像提供了基本事实，这些图像显示了平行于胶原蛋白纤维的条纹。因此，研究者逐像素地比较了从epi检测的P-SHG图像获得的方位图与通过使用OrientationJ对检测的图像进行图像处理获得的方位。

图2. 人眼角膜2个垂直方向的P - SHG取向分布。

图3. 10例人角膜中的胶原取向分布。

根据这种基于角膜两个垂直方向的两次连续P-SHG采集的方法，我们获得了胶原方向分布，这些分布精细地表示了基质片层的方向分布。图3.a至d显示了所研究的10个人类角膜中每个角膜的这些分布的极坐标图。它们要么在角膜厚度的三部分中的每一个计算，要么在整个角膜中计算。它们在10个角膜中具有高度的可重复性，并且沿着鼻颞方向和上下方向一致地显示出两个垂直的峰。这些峰值在后基质中（图3.c）相比前基质中（图3.a）更为突出，并且主要方向从前基质中的下-上轴（图3.a）转移到后基质中的鼻-颞轴。为了量化这些特征，对所有角膜的取向分布进行平均，并使用等式拟合平均分布（图3.e至h）。

研究者的这些结构数据对于理解角膜功能至关重要。角膜的折射能力实际上与其曲率直接相关，因此，尽管眼压每天都在变化，但曲率必须保持恒定。这是通过与频闪的层状结构紧密相连的高度特定的机械性能来保证的。角膜的力学性能通常是使用体内吹气测量来估计的，这并不能提供广泛的力学数据，更完整的离体测量仍然具有挑战性。因此，数值模型对于角膜力学性能和折射能力的预测是强制性的，但只有最近的研究才考虑到角膜的层状结构，由于缺乏准确的定向数据，仍然以简化的方式考虑。这可以通过使用研究者从P-SHG获得的深度分辨片层取向分布来克服，而使用更传统的技术（如OCT、X射线散射或电子显微镜）无法获得具有适当分辨率和精度的这种深度分辨信息。其次，这可以实现对健康角膜以及视力受损角膜的机械行为的改进的数值模拟。最直接的应用是为屈光手术后的基质重塑提供更好的患者特异性预测，从而提高该手术的校正准确性。P-SHG也可用于测量圆锥角膜的片层结构。圆锥角膜是一种发病率越来越高的角膜病理学，其特征是角膜逐渐变薄，在最晚期的病例中，形成严重损害视力的锥体。角膜还具有较差的机械性能（低硬度），这与基质结构的降解有关。然而，到目前为止，还没有关于圆锥角膜片层结构的广泛全深度表征的报道。圆锥角膜纽扣的P-SHG成像可以弥补这一差距，并提供关键数据，从而能够对圆锥角膜的机械特性进行数值模拟。这对于理解圆锥角膜基质重塑至关重要，并可能帮助其早期诊断。

该文章发表在国际顶尖学术期刊《Light: Science & Applications》上，题目为“Unveiling the lamellar structure of the human cornea over its full thickness using polarization-resolved SHG microscopy”。（来源：LightScienceApplications微信公众号）

相关论文信息：https://www.nature.com/articles/s41377‍-023-01224-0