2023年3月16日，四川大学苏昭铭研究员团队在Nature Catalysis期刊在线发表题为“Cryo-EM reveals dynamics of Tetrahymena group I intron self-splicing”的最新研究成果。课题组摒弃了传统的RNA制备方法，构建了四膜虫内含子，并延伸了不同长度的5-和3-外显子的载体，直接进行转录共折叠剪接，使整个RNA分子的剪接过程更接近自然生理状态，以2.84 –3.73 Å的分辨率捕获了与自剪接过程相关的多种构象结构，相对完整地阐述了四膜虫核酶自剪接动力学过程的机制。
核糖核酸（Ribonucleic acid, RNA）是独特的生物大分子，既能储存遗传信息，又可以形成特定的三级结构参与重要的生命过程。核酶（ribozyme）是具有催化特定生物化学反应的功能的非编码RNA分子，类似于蛋白质中的酶，但不依赖于蛋白质。第一个Ribozyme于1982年被Thomas Cech实验室鉴定，他的研究小组发现来自嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）的核糖体RNA前体包含一个内含子（intron），打断基因的非编码序列（Intervening sequence, IVS），它能够在没有任何蛋白质或外部能源的情况下在体外从其所在的mRNA中经过两次转酯反应完成自我剪接。由于发现了“RNA分子的催化特性”，Thomas Cech被授予1989年的诺贝尔化学奖。Ribozyme的发现打破了“酶的本质是蛋白质”这一传统观念，推动了“RNA世界假说（The RNA world hypothesis）”的发展。
Tetrahymena groupI intron是研究RNA催化、RNA折叠和RNA高阶三维结构最具特征的里程碑分子。
在溶液中，大分子构象状态之间动态交替，形成构像聚集体（conformational ensemble），RNA不同构像聚集体之间动力学转换对调节复杂生命过程至关重要。低温冷冻电镜（cryo-EM）已成为探索生物活性RNA的三维折叠构象结构动力学的重要技术。
2021年苏昭铭团队联合斯坦福大学Rhiju Das以及Wah Chiu团队首次解析了全长四膜虫核酶的3.1 Å冷冻电镜结构，发表于Nature期刊，揭示了核酶结合底物前后的构象变化。然而，在四膜虫内含子自剪接过程中发生的多次构象变化的原子级模型在很大程度上仍然未知，限制了对RNA催化过程的动力学和分子机制的理解。
苏昭铭团队的最新研究成果于2023年3月16日在Nature Catalysis期刊在线发表。已有研究证明共转录折叠（co-transcription refolding）对活性前体RNA结构稳定性至关重要。基于此，该研究摒弃了传统的RNA制备方法，构建了四膜虫内含子，并延伸了不同长度的5-和3-外显子的载体，直接进行转录共折叠剪接，使整个RNA分子的剪接过程更接近自然生理状态，以2.84 –3.73 Å的分辨率捕获了与自剪接过程相关的多种构象结构，相对完整地阐述了四膜虫核酶自剪接动力学过程的机制。
图1：四膜虫第一类型内含子自剪接过程
首先，5端外显子和内含子IGS（internal guide sequence）形成P1双螺旋，从起始状态经过中间状态对接到剪接活性位点，活性中心附近J8/7、J4/5和J5/4（joining region，J）与P1形成长程相互作用来介导P1双螺旋精准对接到剪接位点，完成第一步转酯反应；其次，3外显子通过构象变化形成新的P10双螺旋，使用同样的活性中心，完成第二步转酯反应；随后连接好的成熟外显子被释放，内含子5端重新折叠成新的P1双螺旋回归起始位置，准备进行下一步环化反应。
早期功能实验证明外显子影响剪接过程，该研究中团队还首次发现在第二步反应过程中，相隔400多个碱基的两段外显子还可以和内含子形成一个始料未及的假节结构：5外显子和5内含子形成P0，5和3外显子形成P0。通过生化方法对这两部分结构进行突变发现P0对第二步剪接反应速率起到抑制作用，很可能是由于新形成的复杂三维结构阻碍了连接的成熟外显子释放，从而促进了逆反应的发生，降低了正向反应的速率，可能是生物进化上维持生理稳态的一个重要结构（图2）；金属离子，尤其是Mg2+，对于RNA结构的稳定和催化反应至关重要，研究人员在更接近天然状态的结构中进一步鉴定出33个金属离子，包括一个之前从未在结构中观察到的金属离子，并验证了第二步反应是通过经典的两金属离子反应机制。
有些情况RNA会形成强位点结合，但不会与金属或其内球配体形成任何接触。因此，镁通常可以用亚精胺等有机多胺代替，以稳定RNA结合。该研究发现了亚精胺分子存在于RNA活性位点，促进RNA构像稳定。
图2：四膜虫I类内含子和两端外显子形成新的三维结构来调控第二步剪接反应
该项研究为核酶催化机制提供必要的结构信息并推动了核酶研究进展；同时，补充了目前有限的RNA分子结构数据库；丰富了对RNA分子催化、折叠机理的认知；进一步证明了cryo-EM在研究RNA动力学构象变化过程的潜力。（来源：科学网）
相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41929-023-00934-3
