近日，来自德国慕尼黑大学化学系和纳米科学中心的Philip Tinnefeld教授团队提出通过将pMINFLUX的2D定位与石墨烯能量转移（GET）的轴向信息以及DNA-PAINT的单分子切换相结合来实现3D超分辨率纳米显微镜。并以“Combining pMINFLUX, Graphene Energy Transfer and DNA-PAINT for Nanometer Precise 3D Super-Resolution Microscopy”为题发表在国际顶尖学术期刊《Light: Science & Applications》。

研究背景

3D超分辨技术可以实现分子甚至亚分子级别的分辨率，为纳米结构和生物系统提供了全新的视角。目前，已有多种技术将单分子定位显微镜（SMLM）扩展到三维，包括PSF操作、4-Pi显微镜、全内反射荧光显微镜（TIRF）、重复光学选择性曝光（ROSE-Z）或超临界角定位显微镜（SALM）等。然而，在这些技术中，相机定位无法达到三维1-2nm的荧光分子精度。3D受激发射损耗（STED）显微镜的坐标定位方法存在类似的精度限制。为此，研究者们引入了MINFLUX纳米显微镜和后来的MINSTED纳米显微镜。通过使用一系列针对性的照明来查询发射源位置，可以在中等光子下达到小于2nm的精度，通过叠加涡旋光束来生成“拓扑帽”，将其扩展到三维。然而，随着维度的增加，仪器和工程也需要随之增加，光子被分配在轴向和横向维度之间。每个光子只针对横向或轴向定位做出响应。

除了光学方法外，荧光染料的轴向位置可以通过与盖玻片的近场相互作用来确定。为此，从荧光强度或荧光寿命读出染料与金属或石墨烯层之间的能量转移，并将其转换为轴向信息，称为金属诱导能量转移（MIET）或石墨烯能量转移（GET）方法。在玻璃基上的石墨烯盖玻片的GET具有高光学基底透明度（>97％）、无自发荧光和d^-4量级的距离依赖性等优点，可以在其动态范围内实现最高的定位精度。

创新研究

3D纳米级超分辨率显微镜是补充荧光成像与超结构技术的关键。Philip Tinnefeld教授团队通过将pMINFLUX的二维定位与石墨烯能量转移（GET）的轴向信息和DNA-PAINT的单分子切换相结合，实现了三维超分辨率。pMINFLUX和GET代表了一种特殊的协同组合，适用于近表面的超分辨率成像，例如细胞粘附和膜复合物，因为每个光子的信息都用于二维和轴向定位信息。此外，研究者引入了局部PAINT（L-PAINT），其中DNA-PAINT成像链上配备了一个用于局部浓缩成像的额外序列。pMINFLUX，GET和DNA-PAINT的组合代表了一种特别有效和多功能的方法，可以实现纳米级精度的三维超分辨率成像，使其能够直接观察和分析复杂的结构和生物系统，并达到前所未有的详细水平，此外还具有L-PAINT对成像局部聚集的能力。

图1 将pMINFLUX与石墨烯能量转移（GET）相结合，实现精确的3D定位。（a）上图：DNA结构示意图，其中单个染料位于石墨烯上方16nm的高度。下图：单个DNA折纸结构中单个染料分子总荧光强度的轨迹。（b）四个脉冲交错涡旋形光束中的每一个荧光衰减信号，这些光束聚焦在以三角形图案排列的样品上。星形表示染料分子的xy位置。（c）xy定位直方图。（d）荧光寿命分布。（e）从（d）的荧光寿命计算石墨烯z的距离分布。（f）使用pMINFLUX的2D信息和与荧光寿命的z距离对全荧光强度轨迹进行3D定位。单独的定位以黑色显示，在侧面显示了相应的投影，x、y为1nm，z为0.2nm。

研究人员展示了所有三维的定位精度都小于2nm，轴向精度达到0.3nm以下。在3D DNA-PAINT测量中，结构特征（即在3nm距离处的单个对接链）直接解析在DNA折纸结构上。这些技术对于很多领域都具有重要意义，从基础生物学和生物物理学到材料科学和纳米技术，很可能会在未来几年开创许多科学发现和技术创新的机会。

图2 p-MINFLUX和GET组合的性能。（a）用N＝2000的固定光子数分析具有12至30nm范围内不同染料位置的示例性分子与石墨烯的距离z的分布。（b）用于评估精度的单个固定染料在与石墨烯z相距16nm处的示例性3D定位图，其具有不同数量的光子N。（c）x、y和z的定位精度是放置在不同高度的固定染料分子的光子数N的函数。灰色条纹表示MINFLUX在相应实验中的x、y精度，线条表示精度的理论下限。

图3 用pMINFLUX和GET进行超分辨率DNA-PAINT成像。（a）具有突出对接部位的成像结构示意图。（b）DNA-PAINT轨迹的3D定位，侧面有相应的投影。沿x轴和y轴的分格为1.5nm，沿z轴的分格为0.5nm。（c）所选x、y定位到石墨烯z的距离直方图。（d）相对于平均分子位置的x、y定位直方图。

图4 使用pMINFLUX和GET进行L-PAINT成像。（a L-PAINT成像器线束示意图。（b） 一种DNA结构，具有3条突出的链。（c）石墨烯上的DNA结构缩小图。（d）荧光强度迹线，2秒处有一条红线。（e）2秒后L-PANT迹线的3D定位。（f）30秒L-PANT轨迹的3D定位，侧面有相应的投影。（g）xz投影的2D直方图，分格为1nm，定位时间分格从15到50ms不等。（h）到x轴每个平均结合位置的距离直方图。（i）到y轴每个平均结合位置的距离直方图。（j）到石墨烯z的距离直方图。

该研究成果以“Combining pMINFLUX, Graphene Energy Transfer and DNA-PAINT for Nanometer Precise 3D Super-Resolution Microscopy”为题发表在《Light: Science & Applications》。Jonas Zähringer为本文的第一作者，Philip Tinnefeld为本文的通讯作者。（来源：LightScienceApplications微信公众号）

想论文信息：‍https://www.nature.com/articles/s41377‍-023-0‍1111-8