近日，中山大学中山眼科中心教授张秀兰团队与剑桥大学教授Patrick Yu-Wai Man合作，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术靶向敲除碳酸酐酶2（Car2）基因，在小鼠模型上单次给药获得持续降低眼压两个月以上的显著作用，为青光眼提供了广谱、长效降低眼压基因治疗的可能性。相关成果发表于《细胞报道医学》。

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研究摘要图。研究团队供图

“我们打破了传统基因治疗研究框架，从临床实际需求出发，寻找到适合所有青光眼类型的Car2基因进行广谱基因治疗研究。”论文共同通讯作者张秀兰表示，该研究成果具有极大的临床转化潜力，基因编辑药物有望替代传统药物治疗手段，实现“One shot gene therapy——单次给药，长效降压”的目标，为所有类型的青光眼患者减轻疾病负担。

青光眼是全球范围内第一大不可逆致盲性眼病。基因编辑能够提供单次干预、长效治疗的可能，是青光眼理想的治疗工具。张秀兰团队历经3年多时间的潜心研究，从临床降眼压药物的作用机制出发，寻找到适合所有青光眼类型的Car2基因进行广谱基因治疗研究，利用CRISPR-Cas9技术敲除Car2基因，通过单次玻璃体腔注射，在小鼠模型中获得长达两个月的降眼压效果，为青光眼提供了广谱基因疗法的可能性。

张秀兰团队首先针对小鼠Car2基因设计了六条sgRNA序列，并在体外利用T7E1实验结合深度测序技术评估各sgRNA的基因编辑效率。为了进一步提高基因编辑效率，团队筛选出两条sgRNA并构建双靶点CRISPR系统，结果表明基因编辑效率被显著提升至97.3%。接着，为了验证Car2基因敲除是否能够降低眼压，该团队将双靶点CRISPR系统包装至ShH10血清型的腺相关病毒（AAV）载体中。ShH10-AAV对负责房水生成的睫状体组织有很高的亲和性。通过单次玻璃体腔注射，团队证明双靶点CRISPR系统能够靶向睫状体组织，减少CAR2蛋白的表达。眼压监测结果也表明Car2基因敲除能够显著降低正常小鼠的基线眼压，相较于对照组减少约3mmHg，并且持续两个月以上。

为了进一步探索Car2基因敲除对青光眼的治疗效果，研究团队采用了DBA/2J小鼠和磁珠诱导慢性高眼压模型两种实验性青光眼模型。结果表明Car2基因敲除能够显著降低青光眼模型小鼠的眼压，并且能够延缓甚至阻止高眼压带来的组织学损伤。此外，在慢性高眼压模型中，以临床常用降眼压药物派立明（布林佐胺）滴眼液作对比，发现Car2基因敲除降眼压效果要略优于派立明，该发现极大促进了基因编辑药物替代传统药物治疗青光眼的可能性。

尽管眼球凭借“免疫豁免”是理想的基因治疗靶器官，但由于AAV病毒缺乏组织特异性，无法避免视网膜的转染，因此张秀兰团队通过组织学和功能学评估Car2基因敲除的安全性和潜在副作用。OCT以及ERG结果表明，Car2基因敲除未引起潜在的不良反应。

相关论文信息：https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2024.101524