01 导读

近日，英国卡迪夫大学生物科学学院的Iestyn Pope等人开发了一种基于小金纳米颗粒单探针的光电关联显微技术（CLEM），通过使用共振四波混频（FWM）光学显微镜在纳米级精度下定位与表皮生长因子蛋白结合的单个金纳米粒子，并实现了与相关透射电子显微镜图像的高精度映射。当使用半径为10纳米和5纳米的纳米颗粒时，在10微米的区域内获得了低于60纳米的相关精度，且无需额外的基准标记；此外，通过进一步减小系统误差，相关精度可提高到40纳米以下，定位精度可低于10纳米；FWM显微镜具有偏振分辨特性，对纳米颗粒的形状敏感，未来有望通过形状识别实现检测复用。由于金纳米颗粒具有良好的光稳定性，且FWM显微镜对活细胞具有良好的适用性，这种FWM-CLEM显微技术为基于荧光的成像技术提供了有效的替代方案。

02 研究背景

光电联用显微技术（CLEM）融合了光学显微镜（LM）和电子显微镜（EM）的优点，在生命科学领域越来越受关注。CLEM旨在将LM的活细胞成像能力、大视野和分子特异性优势与EM的高分辨率和提供超微结构信息特性相结合，以纳米至原子分辨率的精度确定细胞结构内的特定事件并可视化分子组分。为了在这种情况下高精度地确定感兴趣的生物分子的位置，需要使用LM和EM中都可见的探针标记，为不同的成像模式选择并制备合适的探针是非常关键的。

常用的商业探针结合荧光基团与金纳米粒子（AuNP），如使用Alexa594荧光染料和直径5纳米的AuNP与配体转铁蛋白结合，然而由于AuNP的非辐射能量转移会引起荧光淬灭效应，会显著减小探针在CLEM中的适用性。半导体纳米晶体，也叫量子点（QDs），代表了另一种CLEM探针。QDs通常在生物应用中需要一层保护壳层减小其细胞毒性，这会增加其尺寸；此外，QDs存在间歇性荧光闪烁，这些问题限制了其应用。另一方面，在EM的样品制备中的固定和染色操作难以保留单一的荧光染料探针的荧光发射特性。冷冻光学显微镜在低温下能增加荧光的光稳定性，但通常具有技术上的挑战，如需要使用高度稳定的定制低温台，同时为避免样品晶化需要高数值孔径目镜等。此外，为实现LM和EM两种模态中图像之间的相关精度，通常需要引入标记物，增加样品制备的复杂性。

另一种方法是使用小金纳米粒子（AuNP）作为单一探针。这些纳米粒子在电子显微镜中很容易可见，并在其局域表面等离激元共振(LSPR)波长处表现出强烈的光散射和吸收。与荧光染料相比，它们光稳定性强，具有显著优势。然而，常规的单光子（即线性）光学显微镜难以区分小AuNP与细胞的自发荧光背景。

人们利用AuNP的四波混频（FWM）非线性效应，与LSPR波长产生三重共振，已经实现了在散射细胞和组织内检测到单个小AuNP（半径小于5纳米），摆脱背景限制，仅受到光子射击噪声的影响。

在这项工作中，研究人员展示了一种使用小AuNP作为单个探针的CLEM工作流程，通过利用AuNP的FWM效应，实现LM和EM中哺乳动物癌细胞中表皮生长因子（EGF）蛋白的同步成像。利用AuNP的光稳定性，实现了常温环境下以纳米级精度定位观察单个AuNP的位置，且无需额外的基准标记即可提供EM与LM的高精度关联。

03 创新研究

图1a展示了实现FWM技术的实验原理图，利用了同一激光源产生的泵浦光、参考光和探测光，其中心频率相同，且与小AuNP的局域等离激元共振频率匹配，探测到的FWM可以理解为泵浦引起的AuNP介电函数的改变，表现为探测光束的散射变化。作者使用高数值孔径（NA）物镜将泵浦光和探测光聚焦到样品上，并在反射光路中收集FWM信号。为了通过泵浦光和探测光来检测FWM，使用了一个混频检测方案，其中泵浦光被调制在νm处，探测光频率被调制在ν2处，在频率ν2±νm处检测FWM和参考光之间的干涉。图1b显示了在FWM图像中可高精度定位单个AuNP的中心位置。图1c展示了这种检测方案避免了非相干背景信号（如自发荧光）的影响，且通过FWM和EM两种技术都可高对比度地观察到单个AuNP探针的空间位置。

图2显示了CLEM系统的相关精度分析结果。图片是将变换后的FWM场振幅（黄色）和透射电镜（TEM）图像（灰色）的叠加形成的，获得的相关精度为54纳米。

图3展示了在HeLa细胞中使用半径为5纳米AuNP进行的CLEM成像示例。结果表明，这种小尺寸的单个纳米颗粒可以被清晰地分辨出来，不受噪声和背景的影响，获得的相关精度为58纳米。

图4为考虑到FWM定位AuNP质心位置时受离焦像差的影响，因此通过精细的轴向三维（3D）扫描确定HeLa细胞中半径10纳米AuNP的最佳焦平面坐标，从而消除离焦像差的影响，获得的CLEM系统的相关精度为36纳米。

图1 基于FWM成像的相关光电子显微镜。 a）FWM装置示意图。 b）单个半径10纳米AuNP的体积FWM显微成像示例。c）利用CLEM系统观测HeLa细胞中与EGF蛋白结合的半径10纳米的AuNP。

图2 CLEM系统相关精度分析。FWM场振幅（黄色）和TEM图像（灰色）的叠加图。

图3 使用半径5纳米的AuNP获得的CLEM相关精度。

图4 利用3D-FWM获得的CLEM相关精度。

该文章被发表在《Light: Science & Applications》期刊上，题为“Correlative light electron microscopy using small gold nanoparticles as single probes”，Iestyn Pope为第一作者，Paola Borri和Paul Verkade为共同通讯作者。（来源：LightScienceApplications微信公众号）

相关论文信息：‍https://www.nature.com/articles/s41377‍-023-0‍1115-4